01 前言

 

地球上的生物，除少量 RNA 病毒外，包括人类在内，均以 DNA 为遗传物质，这就使得某些生物技术在不同物种之间可以通用， CRISPR/Cas 作为一种基因编辑技术，就是一个典型的例子。

 

2020 年 10 月，诺贝尔化学奖颁给了法国生物化学家 Emmanuelle Charpentier 和美国生物化学家 Jennifer Doudna，以表彰她们在基因编辑方面做出的杰出贡献，也让 CRISPR/Cas 技术被大众所知。美籍华裔科学家张锋此次虽与诺贝尔奖失之交臂，但他因证实了 CRISPR 能够在真核细胞中起作用，揭示了它的巨大潜力，一直与以上两位获奖者并称为“CRISPR 三巨头”。后续又有多位专家学者为此技术添砖加瓦，使其成为“变革生物学的技术”。

 

 

事业发展部将推出系列文章“CRISPR/Cas 技术的前世今生”，为大家系统地梳理此技术的发展历程及应用前景，今天为第一篇《CRISPR/Cas 系统的发现》。

 

02 介绍

 

我们大家都知道以人类为代表的高等生物有免疫系统，可以执行免疫功能，抵抗病原体入侵。人类的免疫系统极为复杂，仅免疫细胞就有执行抗原呈递功能的树突状细胞，产生抗体的 B 细胞，执行细胞免疫的多种 T 细胞等，那么细菌这种单细胞生物是否也有抵抗病原体入侵的“免疫系统”呢？答案是肯定的。 早在 1987 年，Ishino Y 等[1]在研究大肠杆菌 iap 基因时发现其下游有一组重复序列，与典型的重复形式不同之处在于这种重复序列中间含有 32nt 的非重复序列。但是，当时他们并不知道这些重复序列的功能。1995 年，Mojica F J 等[2]在地中海极嗜盐菌和沃尔卡尼极嗜盐菌中发现了类似的结构。之后在其他的一些细菌和古细菌中，类似的结构不断被报道，证明该结构的广泛存在。 2002 年，Jansen R [3]为准确反映该类串联重复序列的结构特征，以便对其功能进行深入研究，将其正式命名为 CRISPR（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats，规律间隔成簇短回文重复序列）。在接下来的一段时间里，人们发现有超过 40% 的细菌和 90% 的古生菌含有类似结构的序列。在这种重复序列附近，有多种特征基因，被命名为 CRISPR-associated（Cas），这就是 CRISPR/Cas 名称的由来，但其生物学意义仍然未知。

 

 

图 1：CRISPR 基因和当时已发现的所有 Cas 基因[3]

 

直到 2005 年，Mojica FJ 等[4]发现 CRISPR 系统中的间隔序列（Spacer）可能是来源于外源噬菌体（侵染细菌的病毒）的序列，并且具有某些噬菌体片段的细菌或古生菌不会被对应的噬菌体感染[4-5]。2006 年，美国国立卫生研究院的研究人员通过生物信息学分析预测，CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNAi 方式行使其免疫功能[6]。基于以上事实人们推测，CRISPR 具有免疫记忆和防御的功能，Spacer 通过核酸碱基配对的方式预防侵入的噬菌体。 其后，一系列的验证工作对此进行了证实：CRISPR 系统可以通过将入侵的噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 crRNAs（CRISPR-derived RNAs）来指导同源序列的降解，从而提供类似于真核生物的免疫性。

 

 

图 2：CRISPR/Cas 适应性免疫系统的特征[7]

 

如上图所示，CRISPR/Cas 系统降解外源 DNA 的机制包括三个阶段： 第一阶段为整合阶段， CRISPR 识别入侵的 DNA 中有 NGG 序列，即前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM），以 PAM 为起始，在 CRISPR 基因座 5’ 端合成重复序列，将新的间隔序列整合到两个重复序列之间。 第二阶段为表达阶段，当该 DNA 片段再次入侵时，CRISPR/Cas 系统被激活， CRISPR 转录长的 crRNA 前体，结合系统中相关的 Cas 蛋白后，形成 crRNA Cas 蛋白复合体，进而将 crRNA 前体加工成小的成熟 crRNAs。 第三阶段为干扰阶段，成熟的 crRNA 通过碱基互补配对，精确引导 Cas 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（即外源入侵 DNA）。 CRISPR/Cas 系统是如何从自然存在的细菌“免疫系统”变成灵活多变的基因编辑技术，有赖于两位诺贝尔获奖者和张峰的工作，具体内容见下一篇推文《新型基因编辑技术的诞生》。

 

03  参考文献

 

[1] Ishino, Y., H. Shinagawa, K. Makino, et al., Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product [J].J Bacteriol, 1987. 169(12): p. 5429-5433.

[2] Mojica, F.J., C. Ferrer, G. Juez, et al., Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replico n partitioning [J] M ol Microbiol, 1995. 17(1): p. 85-93.

[3] Jansen, R., J.D. Embden, W. Gaastra, et al., Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes [J] Mol Microbiol, 2002. 43(6): p.1565-1575.

[4] Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, et al., Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derivefrom foreign genetic elements [J]. J Mol Evol2005;60: p.174-182.

[5] Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elementsin Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophageDNA, and provide additional tools for evolutionary studies [J]. Microbiology 2005; 151: p.653-663.

[6] Makarova, K.S., N.V. Grishin, S.A. Shabalina, et al., A putative RNA interference based immune system in prokary otes: computational an alysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action[J] Biol Direct, 2006. 1: p. 7.

[7] Bhaya, D., M. D avison, and R. Barrangou, CRISPR Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation [J] Annu Rev Genet, 2011. 45: p. 273-297.