CRISPR/Cas  应用领域简介

    

CRISPR/Cas 基因编辑技术诞生至今虽然只有短短十年时间，但由于其强大的功能，科学界已投入巨大的资源进行研究，在众多领域中开发出多项足以改变现代生物学进程的先进技术。该技术虽可实现体内基因编辑，用于治疗遗传学疾病，但由于安全性和伦理学方面的质疑，进展较为缓慢，多项实验仍处于临床前期。CRISPR/Cas 基因编辑技术在其他多领域已有应用，可以根据 Cas 蛋白的类别和功能进行分类，也可以根据具体应用领域进行分类。以下我们从应用领域方面进行梳理。

 

#1  在植物改良中的应用

 

各种农作物在维持人类生活中发挥着不可或缺的作用。长期以来，育种者努力通过传统育种策略提高作物产量和质量。现代分子生物学的突破给育种者带来更大的可能性。

 

传统的基因编辑技术将目标基因随机整合到受体基因组中，可预测性差并且可能引起基因沉默和意外变异等问题。凭借其强大的技术优势，CRISPR/Cas 系统诞生后立即成为分子生物学的一个重要领域。

 

CRISPR/Cas 系统在植物中的应用可以是 Cas9 产生的 DSB 通过非同源末端连接（NHEJ）方法修复以产生插入缺失，这导致类似于自然变体的移码突变[1]，也可以是通过遗传转化方法将 Cas9 和 sgRNA 这两种成分传递到宿主细胞进行育种[2]，还可以是通过将失活的 dCas9 融合到效应域来对植物中靶基因的转录进行 RNA 引导、稳定和有效的调节[3]。仅 2016 年至 2020 年，CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑在 41 种粮食作物、15 种经济作物、6 种油料作物、8 种观赏作物、1 种纤维作物和饲料作物中得到报道，科学家已尝试了对包括外观、延长保存期、适口性、营养成分强化等优选特性的改良[4]。

 

#2  生物医学建模（新药开发）

 

基于 CRISPR 的基因组工程技术可促进体内和体外疾病模型的快速生成。新的方案包括：

 

1  通过直接注射 sgRNA 和 Cas9 mRNA 在单细胞胚胎中进行基因组编辑。这种方法已成功用于生成小鼠[5]、大鼠[6]和猴子模型[7]，从而揭示了 CRISPR-Cas9 系统在高效和快速创建转基因动物中的全部潜力，其中一个或多个基因可同时更改。

 

2  体内基因编辑，将 CRISPR-Cas9 系统直接递送到天然组织中的特定细胞，从而绕过对种系突变的需求。这种替代方法可以应用于现有的疾病模型和转基因菌株，并在基因治疗策略中具有广阔的应用前景。通过使用病毒载体（主要是腺相关病毒）实现了体内编辑 ，具有明确的组织特异性嗜性[8 ,9]。

 

3  基因编辑与人类诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSC） 的结合，可以生成遗传复杂疾病的模型。使用这种方法，可以研究各种遗传背景下的人类基因组改变。来自患者的 iPSCs 在培养物中进行分化，以识别可用于在体外研究疾病发病机制的细胞。CRISPR 可用于恢复来自疾病个体的 iPSC 中的靶向突变，从而阐明此类突变的影响并为基因治疗提供原理证明[10]。

 

科学家使用 CRISPR 法已完成包括癌症、神经系统疾病、心血管疾病、传染病、免疫缺陷病等众多疾病的生物学建模，为现代医学的发展提供重要助力。

 

 

#3  在疾病诊断中的应用

 

传染病是对人类最可怕的威胁之一，造成了巨大的残疾和死亡负担。传染病的快速诊断有助于更好地了解其发病机制，控制疫情。基于 PCR 的检测试剂盒不仅耗时耗人工，而且对于仪器要求较高，无法达到快筛的效果，基于抗原的快筛试剂盒准确度不够。快速而准确地对单分子核酸靶标进行检测的方法有待开发。

 

2017年，Jennifer Doudna 课题组[11]提出了名为 DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter（简称DETECTR）的 CRISPR/Cas 诊断工具，使用 Cas12a 蛋白。2018 年，张锋等[12]提出了基于 CRISPR/Cas VI 型系统 Cas13 的 Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing 技术（简称 Sherlock）的 CRISPR/Cas 诊断工具，并成立 Sherlock Biosciences 公司。Sherlock 的原理是对特殊的 CRISPR/Cas 酶进行编程，以通过“智能扩增子检测”样本中特定核酸特征的存在。当检测到靶基因时，CRISPR/Cas 酶被激活以产生强大的信号。该信号可在实验室设备中进行简单的纸条测试，也可以提供通过手机读取的电化学读数，具体操作如下[13]。

 

 

目前，基于 CRISPR 的诊断可实现对 HPV、新冠病毒、寨卡病毒等多种转染病的快速检测。与 PCR 相比，SHERLOCK 和 DETECTR 无需大量复杂处理，提供了超灵敏测试结果，未来有可能改变我们识别细菌、传染病、肿瘤 DNA 或癌症的能力。

 

 

#4   在癌症治疗方面的应用

 

CRISPR/Cas9 工具除在肿瘤模型建立、癌症诊断中有应用潜力外，还可以提供 TCR 敲除 CAR-T 细胞（通用型 CAR-T 细胞）、消除致癌病毒（如 HPV）、抑制性受体（如 PD-1 和 LAG-3）的敲除以促进癌症免疫治疗的能力等。利用 CRISPR/Cas9 建立 CAR-T 疗法目前进入临床阶段或处于临床前期的主要有：南京生物恒生物科技有限公司的 CTA101，用于治疗复发或难治性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病等（临床 I 期开始于 2019 年 11 月）；KSQ Therapeutics 公司 KSQ-001，自体 CAR-T，治疗实体瘤，处于 IND 阶段；另有 Precision BioSciences 公司和 Poseida Therapeutics 公司的项目处于临床前阶段。

 

以目前已进入临床实验的通用 CAR-T 细胞开发为例，病人自身的免疫系统较弱，无法提取出足够量 T 细胞，或使用病人自身改造的 T 细胞达不到治疗的效果，CRISPR/Cas 系统可以将正常人 T 细胞表面的 HLA 分子敲除，生成通用 CAR-T 细胞，用于癌症病人治疗[14]。

 

#5 在治疗罕见病领域的应用

 

狭义的 CRISPR/Cas 基因治疗指使用基因编辑方式直接或间接编辑导致遗传疾病的基因。目前国际上有 CRISPR Therapeutics、Editas Medicine、Intellia Therapeutics 等公司，共有近十个项目处于临床阶段，进展最快的是 CRISPR Therapeutics 公司的 CTX001，用于治疗输血依赖性 β-地中海贫血（TDT）和重度镰状细胞病（SCD）的两项 III 期临床实验分别于 2022 年 4 月和 2022 年 7 月完成注册，其余项目均处于临床 I 期。该技术由于安全性和伦理学等方面的质疑，整体进展较为缓慢。下一篇我们将详细介绍使用 CRISPR/Cas 技术治疗罕见病的头部公司。

 

 

参考文献

 

【1】Brooks C., Nekrasov V., Lippman Z., et al., Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR/Cas9 system [J]. Plant Physiol,2014.166: 1292–1297.

【2】Xing H.L., Dong L., Wang Z.P., et al., A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants [J]. BMC Plant Biol, 2014,14:327

【3】Larson M. H., Gilbert L. A., Wang X., et al., CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression [J]. Nat. Protoc, 2013. 132: 2180–2196.

【4】Qier L., Fan Y., Jingjuan Z., et al., Application of CRISPR/Cas9 in Crop Quality Improvement [J]. Int J Mol Sci. 2021, 22(8): 4206-4221.

【5】Bin S., Jun Z., Hongya W., et al., Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting [J]. Cell Res. 2013, 23(5):720-723.

【6】Shao Y., Guan Y., Wang L., et al., CRISPR/Cas-mediated genome editing in the rat via direct injection of one-cell embryos [J]. Nat Protoc. 2014,9:2493–2512.

【7】Niu Y., Shen B., Cui Y., et al., Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos [J]. Cell. 2014, 156:836–843.

【8】Porteus M.H., Towards a new era in medicine: therapeutic genome editing [J]. Genome Biol 2015;16:286.

【9】Kotterman M.A., Schaffer D.V., Engineering adeno-associated viruses for clinical gene therapy [J]. Nat Rev Genet. 2014, 15:445–451.

【10】Delilah H., Hans C., Benedetta A. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids[J]. Stem Cell. 2020,27(5):705-731.

【11】Chen J.S., Ma E., Harrington L.B., et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity[J]. Science. 2018, 360:436–439.

【12】Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Lee J.W., et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J]. Science. 2017, 356:438–442.

【13】节选自https://sherlock.bio/platforms/crispr/

【14】Sadegh S.B., Zhanna R. G., Saeme A.H., et al., CRISPR/Cas9 application in cancer therapy:a pioneering genome editing tool[J]. Cellular & Molecular Biology Letters. 2022, 27(1):35.