01 介绍

 

上一篇文章已向大家介绍了 CRISPR/Cas 系统的自然来源，即细菌的“免疫系统”。CRISPR 与 gRNA 定位于特定的入侵病毒 DNA 位点，Cas 酶将其切断，对于入侵细菌的病毒而言，其序列断裂意味着病毒无法继续侵害宿主细菌，即进攻失败，细菌得到保护。以上为对 CRISPR 生物学原理的研究，是 CRISPR 基因编辑技术开发的起点。

 

在 CRISPR 之前，基因编辑领域有两大相对独立的技术，即锌指蛋白（ZFNs）和转录激活样效应因子核酸酶（TALEN），2011 年，科学家首次在哺乳动物/人类细胞实现了 TALEN 基因调控编辑[1]。但这两项技术都依靠蛋白质与 DNA 之间的相互作用来定位编辑区域，每一个编辑位点都需要冗长而繁琐的设计与筛选，不仅工作量大，而且最终编辑效率低下，错误率高，难以推广。CRISPR 的出现，改变了这一局面，CRISPR 利用 gRNA 与基因组 DNA 碱基互补配对原则进行定位，理论上可高效避免错误定位，实现精准编辑。

 

2011 年始，CRISPR 基因编辑技术的研发工作在多个研究组独立进行，包括法国生物化学家 Emmanuelle Charpentier、美国加州大学伯克利分校的 Jennifer Doudna（两位因对 CRISPR 基因编辑技术的贡献获得了 2020 年诺贝尔化学奖）和刚刚获得美国麻省理工学院助理教授职位的华裔科学家张锋等。

 

Jennifer Doudna 于 2012 年发表了多篇在原核细胞或体外试管实验中成功检测到了 CRISPR 的编辑活性的文章，并将其对 CRISPR 的改造撰写综述性文章[2]，主要改造点为序列的启动子、核糖体结合位点 (RBS) 和编码在非翻译区 (UTR) 中的顺式调节信号的组合，使其可以通过与 gRNA 结合，形成可影响全基因组的模块化系统。Emmanuelle Charpentier 的实验也仅在细菌和古细菌中进行[3]，其专利中涉及的实验更是仅在体外试管实验中成功检测到了 CRISPR 的编辑活性。

 

 

图 1：CRISPR RNA 处理系统对标准遗传元件进行工程改造[2]

 

人类细胞的结构和环境复杂度远远高于细菌，所以在生物学历史上，大量技术虽然适用于细菌或体外，但未能在人类细胞中实现。两位诺贝尔奖获得的者也承认在那个时期“techniques for making these modifications in animals and humans have been a huge bottleneck”，她们的团队当时在这个方向的尝试遇到了 “many frustrations”。 真正完成此开拓性壮举的是华裔科学家张锋和他所在的博德研究所团队（隶属于美国麻省理工学院和哈佛大学）。 虽然张锋实验室的第一篇关键论文为 2012 年底送审，2013 年初发表于《Science》[4]，晚于两位诺贝尔奖获得者，但其实验室在 2011 年 2 月就有了真核细胞 CRISPR 基因编辑技术的概念设计，有公开的存档资料为证。所以，其技术设计定然早于两位诺贝尔奖 2012 年发表的论文（这也是三方后续争论不断的源头）。该论文明确对 Cas9 进行密码子优化，启动子优化，并附加了核定位信号 (NLS) 以确保其进入哺乳动物细胞的核区。该构建体在人类 293T 细胞系中的表达，并在人 EMX1 基因中实现了精确的定点编辑。同时，该论文还展示了 Cas9 利用同源重组进行基因编辑和多重基因组工程中的应用。

 

 图 2：来自 化脓性链球菌 SF370 的 II 型 CRISPR 基因座（之后多写作 CRISPR/Cas9 系统）可以在哺乳动物细胞中重组，以促进 DNA 的靶向 DSB[4]

 

 

图 3：Cas9 在同源重组中的应用[4]

 

 

由于真核细胞中 CRISPR 基因编辑技术的复杂性、不可控性，张锋团队仅在 2013 年共发表 8 篇论文，分别在黑色素瘤模型[5]、植物[6]、小鼠[7]等中实现基因编辑。 同时期，哈佛医学院的 George Church 教授也独立完成了通过 Cas9 进行人类基因编辑（在 293T 细胞、 K562 细胞和诱导多能干细胞中）[8]，宣称建立了一种简便、强大的 RNA 引导的编辑工具，但后续对于此技术的开发不如张锋和两位诺贝尔获奖者成果众多。 CRISPR 系统经过多位科学家改造后，可作用于人类或其他真核生物的特定基因组位点，引起 DNA 双链断裂，高等生物的 DNA 双链断裂后有一定的修复机制以确保断裂位置重新链接，但修复后的序列往往与原序列不再相同，即此位点所在的基因功能被破坏，实现基因敲除。如利用同源重组，即加入外源同源序列，断裂处可以被编辑修复，虽然这个阶段修复效率较低，但 CRISPR 已被业界公认为最有力的基因编辑工具。 2020 年，诺贝尔奖仅被授予 Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna，而无张锋，引发外界广泛关注。同时，围绕 CRISPR 旷日持久的专利之争也被披露。2022 年 2 月 28 日美国专利商标局确定博德研究所团队是第一个发明 CRISPR-Cas9 来编辑人类细胞并用于制造药物的团队，而不是诺奖得主 Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 所属的 CVC 团队。Jennifer Doudna 表示，将继续上诉到美国联邦巡回上诉法院。 一种观点认为，虽然张锋在 CRISPR 对哺乳动物基因编辑领域贡献杰出，但编辑哺乳动物基因是发展趋势，没有张锋也会有别人，而两位诺贝尔奖获得者的工作是开创性的，由她们分享诺贝尔奖而无张锋是可以接受的。但专利权归属问题是法律层面的事，看的是谁能拿出更有法律效力的证据和雇佣的专利律师的能力。业界更多的是希望他们将 CRISPR 技术更充分地公开，有助于全球基因编辑技术的发展。

 

02 参考文献

 

[1] Jeffrey C M,Siyuan T, Guijuan Q, et al., A TALE nuclease architecture for efficient genome editing [J]. NatureBiotechnology, 2011. 29: p. 143-148.

[2] Lei Q, Rachel EH, Wenjun S, et al.,RNAprocessing enables predictable programming of gene expression [J].Nature Biotechnology,2012. 30(10): p.1002-1006.

[3] Martin J,Krzysztof C, Ines F, et al.,A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity [J]. Science. 2012 . 337(6096): p.816–821.

[4] Le C, F. AnnRan, David Cox, et al., Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems [J].Science. 2012. 339(6121): p.819–823.

[5] Ophir S, NevilleE. S,EllaH, et al., Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells [J].Science. 2014.343(6166) : p.84-87.

[6] Feng Z, Zhang B,Ding W, et al., Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system [J].Cell Res. 2013. 23(10): p.1229-1232.

[7] Wang H, Yang H,Shivalila C, et al.,One-stepgeneration of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediatedgenome engineering [J]. Cell. 2013. 153(4): p. 910-918.

[8] Prashant M, YangL, Kevin M. E, et al.,RNA-GuidedHuman Genome Engineering via Cas9[J]. Science. 2013. 339(6121):p.823–826.